Western Blot（简称WB）是一种用于检测和分析特定蛋白质的技术。它基于蛋白质在电泳中的分离和转移到固相支持物（如NC膜或PVDF膜），然后使用特异性抗体进行检测的原理。以下是Western Blot的详细原理和步骤：

原理

蛋白质提取 ：从细胞或组织中提取总蛋白质。

电泳分离：

使用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）根据蛋白质分子量大小进行分离。

转膜：

将分离的蛋白质转移到固相膜上，如NC膜或PVDF膜。

阻断：

用非特异性蛋白质（如BSA）封闭膜表面，以减少非特异性结合。

一抗孵育：

使用特异性抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。

洗涤：

用缓冲液洗去非特异性结合的抗体。

二抗孵育：

使用标记有特定荧光素或酶的二抗与一抗结合，形成二次抗原-抗体复合物。

信号检测：

通过化学发光、荧光或酶反应的方法检测并可视化目标蛋白。

步骤

蛋白提取

准备：明确所检测目的蛋白的表达情况，选择合适的样本和处理方法。

蛋白提取：在冰上进行，使用适当的裂解液和破碎方法，确保蛋白质的完整性和活性。

蛋白浓度测定

使用凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法或胶体金法等方法测定蛋白质浓度。

SDS-PAGE电泳分离

将蛋白质样品加入含有SDS的凝胶孔，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据分子量大小分成不同位置的蛋白条带。

转膜

将分离的蛋白迁移到膜上，通常使用半湿式或完全湿式电转膜系统。

阻断和孵育

用非特异性蛋白质（如BSA）封闭膜表面，然后用特异性一抗与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。

洗涤：用缓冲液洗去非特异性结合的抗体。

二抗孵育

使用标记有特定荧光素或酶的二抗与一抗结合，再次形成复合物。

洗涤：洗去非特异性结合的二抗。

信号检测

根据采用的荧光染料、化学发光或酶反应的方法，检测并可视化目标蛋白。

建议

在进行Western Blot实验时，确保每一步操作都严格遵循标准流程，以避免蛋白质降解或丢失。

选择合适的裂解液和蛋白酶抑制剂，以确保蛋白质的有效释放和稳定。

在电泳和转膜过程中，注意操作的细节，如电压、时间和温度等，以获得最佳的实验结果。