使用乙醇沉淀法浓缩质粒DNA的步骤如下:
提取质粒DNA
从细胞或培养基中提取质粒DNA。
第一次沉淀
将提取的质粒DNA溶液与等体积的预冷5 mol/L NaCl充分混匀。
以1000 rpm离心15分钟,取上清液。
第二次沉淀
向上清液中加入等体积的异丙醇,混匀后室温放置10分钟。
以10000 rpm离心15分钟,收集沉淀。
洗涤沉淀
弃去上清液,将沉淀加入70%乙醇洗涤一次。
风干沉淀10~15分钟。
溶解沉淀
将风干后的沉淀用500 μL含RNA酶的TE(pH 8.0)溶解,室温放置30分钟。
(可选)将质粒DNA混合物用酚:氯仿抽提一次,然后用氯仿抽提一次。
第三次沉淀
向溶解后的DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇,混匀。
风干沉淀10分钟。
第四次沉淀
向风干后的沉淀中加入1 mL灭菌水溶解,再加入500 μL PEG-MgCl₂溶液,充分混合,室温放置10分钟。
以12000 rpm离心15分钟,收集沉淀。
第五次沉淀
弃去上清液,用70%乙醇重悬沉淀,再次以12000 rpm离心15分钟。
重复此步骤以进一步去除杂质。
最终溶解
弃去上清液,将最终沉淀用70%乙醇处理一次。
将质粒DNA溶解于500 μL TE(pH 8.0)中。
定量和保存
取1 μL质粒DNA,100倍稀释后测OD260,计算DNA的浓度。
将剩余的质粒DNA分装,-20°C保存备用。
通过以上步骤,可以有效地浓缩质粒DNA,并去除大部分杂质。建议在操作过程中注意离心的速度和温度,以确保DNA的完整性和活性。